Otimização de um alto

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 4588 (2023) Citar este artigo

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15 Altmétrica

Detalhes das métricas

Ferramentas sensíveis para a detecção de sorotipos pneumocócicos colonizadores simultâneos são necessárias para uma avaliação detalhada do impacto direto e indireto da imunização de rotina com a vacina pneumocócica conjugada (PCV). Um conjunto de reações de PCR nanofluídico quantitativo em tempo real (Standard BioTools 'Fluidigm') de alto rendimento foi desenvolvido para detectar e quantificar 92 sorotipos pneumocócicos em amostras clínicas arquivadas. Swabs nasofaríngeos coletados em 2009–2011 de crianças sul-africanas ≤ 5 anos de idade, previamente sorotipados com métodos baseados em cultura padrão, foram usados para comparação. O conjunto de reações dentro do 'Fluidigm' amplificou efetivamente todos os alvos com alta eficiência (90–110%), reprodutibilidade (R2 ≥ 0,98) e baixo limite de detecção (< 102 CFU/ml). Uma análise cega de 1.973 amostras de swab nasofaríngeo mostrou sensibilidade diagnóstica > 80% e especificidade > 95% em comparação com o padrão de referência, método Quellung baseado em cultura. O método qPCR foi capaz de sorotipar tipos pneumocócicos com boa discriminação em comparação com Quellung (ROC-AUC: > 0,73). O método de PCR nanofluídico em tempo real de alto rendimento detecta simultaneamente 57 sorotipos individuais e 35 sorotipos em 16 sorogrupos em 96 amostras (incluindo controles), em uma única execução de qPCR. Este método pode ser usado para avaliar o impacto das formulações atuais de PCV na colonização de sorotipos vacinais e não vacinais, incluindo a detecção de múltiplos sorotipos colonizadores simultâneos. Nosso método qPCR pode permitir o monitoramento da carga bacteriana específica do sorotipo, bem como o surgimento ou transmissão contínua de sorotipos menores ou co-colonizadores que podem ter potencial de doença invasiva.

A cápsula do Streptococcus pneumoniae é composta por polissacarídeos repetitivos codificados geneticamente pelo locus Capsular Polysaccharide Synthesis (CPS) que confere heterogeneidade serotípica1,2. Existem 100 sorotipos de S. pneumoniae bioquimicamente e sorologicamente distintos3. A diversidade capsular é um importante fator de virulência em S. pneumoniae4 e os sorotipos têm diferentes potenciais de causar doença em humanos5. As Vacinas Pneumocócicas Conjugadas (PCV) previnem a aquisição do portador do sorotipo vacinal pneumocócico (VT), que é um precursor da doença6,7,8,9,10. O primeiro PCV licenciado (PCV7) visava sete sorotipos, a saber: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Os PCVs atuais em uso em nosso meio incluem três sorotipos adicionais (PCV10: 1, 5 e 7F) e seis (PCV13: 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A). Os PCVs de 15 e 20 valências de próxima geração estão em ensaios clínicos e incluem dois sorotipos adicionais (22F e 33F)11 e sete (8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F)12, respectivamente, em comparação com o PCV13.

A vigilância da colonização pneumocócica da via aérea superior é útil para avaliar o impacto da imunização PCV em nível populacional13. Pesquisas de colonização pneumocócica são melhor realizadas usando métodos de sorotipagem abrangentes, sensíveis e precisos, capazes de detectar cotransporte de múltiplos sorotipos, incluindo VT e sorotipos não vacinais (NVT). A vigilância consistente dos sorotipos circulantes é necessária para informar as estratégias de vacinação e a utilização de PCVs de valência mais alta ou alternativa, inclusive adaptada para diferentes regiões geográficas; e para a detecção de sorotipos emergentes ou de substituição13.

Os métodos Quellung baseados em cultura continuam sendo o padrão-ouro para a sorotipagem de S. pneumoniae; no entanto, esses métodos são demorados, com baixa sensibilidade e custosos14,15. Em comparação com métodos baseados em cultura, a detecção e a sorotipagem baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) não dependem da viabilidade do organismo que pode ser afetada negativamente pelo uso de antibióticos, transporte de amostras e condições de armazenamento, consomem menos tempo, fornecem diagnóstico mais rápido e maior sensibilidade15 . A PCR convencional e em tempo real tem sido usada, incluindo PCRs nested e multiplex de tubo único com eletroforese em gel ou capilar e combinada com detecção de dot-blot, enriquecimento de cultura e análise baseada em sequenciamento16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. Métodos de PCR em tempo real foram desenvolvidos com um número crescente de sorotipos detectados21,29,30,31, inclusive em sistemas de alto rendimento15,32,33. Além disso, os métodos quantitativos de PCR (qPCR) validados para determinar a carga bacteriana29,31,32,34 são importantes para avaliar o impacto das vacinas em programas de saúde pública. O aumento da carga bacteriana na nasofaringe pode predizer o potencial de doença invasiva específica do sorotipo31.

0.98, Table 1), allowing for relative quantification of bacterial load using the slope of the linear equation. The linear dynamic range for these assay-sets was at least 5-log fold. Further, Levy-Jennings plots constructed using assay-set specific reference calibrators were within ± 2.0 SD of the mean Cq value across all plates. This validated the use of the designed calibrators (gBlocks). The assay-sets for the detection of E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, the Xisco gene of S. pneumoniae and the Bacterial 16S ribosomal RNA gene (listed in Supplementary Table S1) did not perform well within this reaction-set, as the efficiency was < 90% or > 110% or r2 < 0.98 (Supplementary Table S5)./p> 80% sensitivity (Table 3) in the 1 973 archived clinical samples for 36 assay-sets. The diagnostic sensitivity for six assay-sets (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B and 35A/C/42) was lower (50–74%, Table 3) as the prevalence of the targeted serotypes detected by Quellung was ≤ 1% whereas additional targeted serotypes were detected using ‘Fluidigm’ qPCR (Fig. 3). The remaining assay-sets could not be assessed as explained above. The diagnostic specificity was high (> 95%) for all assay-sets where targeted serotypes were previously detected by Quellung (Table 3)./p> 0.05; Table 3). The ‘Fluidigm’ reaction-set was able to identify an additional 39.1% (826/2113) serotypes above those detected by culture for the compared assay-sets in Table 3, and conversely culture detected 132 (9.3% of 1419) serotypes not identified by ‘Fluidigm’ qPCR (Table 3, Fig. 3)./p> 0.98). Notably, the detection of additional serotypes (39.1%) by the ‘Fluidigm’ qPCR panel described here with 96 assay sets, is comparable to the ‘Fluidigm’ panel described previously (also 39.1%), that included 48 assay sets32. Compared with the gold-standard culture based-Quellung method, our reaction-set was 98.8% accurate for the classification of pneumococcal serotypes. Further, the average sensitivity across the qPCR reaction-set was 89.1% compared with Quellung./p>

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